Fluorescence: Poisson statistics and algorithms for spectral decomposition

Fluorescence microscopy is a key technique in biophysics, yet its quantitative interpretation is often limited by spectral crosstalk and noise. In this paper, the photon counting statistics of fluorescence emission are examined, and it is experimentally confirmed that, under typical imaging conditions, detected photons follow Poisson statistics. Small deviations are observed only at high fluorophore concentrations, where fluorescence quenching becomes significant. This result is essential for spectral decomposition, as the Richardson--Lucy unmixing algorithm relies on a Poisson noise model. A comparison between the standard linear unmixing algorithm and the Richardson--Lucy algorithm is performed, showing that the latter provides superior performance, especially in the case of low signal-to-noise ratio data. Together, these findings demonstrate that improved multicolor fluorescence imaging and more reliable biological interpretation are enabled by accurate unmixing algorithms.

Fluorescenca: Poissonova statistika in algoritmi za spektralno dekompozicijo

Fluorescenčna mikroskopija je ena izmed ključnih tehnik v biofiziki, vendar je njena kvantitativna analiza pogosto omejena zaradi prekrivanja emisijskih spektrov in šuma. V tem članku je proces štetja fotonov pri fluorescenci statistično analiziran, pri čemer je eksperimentalno pokazano, da pri tipičnih pogojih slikanja zaznani fotoni sledijo Poissonovi statistiki. Manjša odstopanja so opažena le pri visokih koncentracijah fluoroforja, kjer pride do potlačitve fluorescence. Ta rezultat je ključen za spektralno dekompozicijo rezultatov, saj se Richardson--Lucy algoritem opira na Poissonov model za opis fluorescence. V članku je izvedena primerjava med pogosto uporabljenim algoritmom linearne dekompozicije slik in Richardson--Lucy algoritmom, pri čemer je pokazano, da slednji zagotavlja boljše rezultate, zlasti pri meritvah z nizkim razmerjem signal--šum. Ti rezultati nakazujejo, da algoritmi, ki temeljijo na ustrezni statistiki fizikalnega pojava, omogočajo izboljšano večbarvno fluorescenčno mikroskopijo in s tem zanesljivejšo biološko interpretacijo.